Explorez la Chimie Click améliorée pour des bioconjugaisons efficaces

La chimie Click implique des réactions spécifiques, pratiques et biocompatibles de 2 groupes chimiques ‘partenaires’ qui n’interfèrent pas avec les groupes chimiques natifs des biomolécules de l’échantillon, ni avec les réactions biochimiques du métabolisme des systèmes vivants (ce qui est appelé ‘bioorthogonalité’)*. Le terme Click est à présent forgé notamment pour des couplages (conjugaison) contrôlés, entre molécules et/ou supports solides, avec des échantillons biologiques complexes. Ceci rend la chimie Click largement employée comme technique polyvalente de conjugaison, in-vitro comme in vivo, des composés naturels ou xénobiotiques, entre eux ou avec un marqueur ou un support, et faire des sondes en vue de détections générales ou spécifiques ou pour des applications de purification.

Schéma 1 : Principe des bioconjugaisons par chimie click

*rem: des modalités particulières d’application de réactions Click permettent à l’inverse d’interférer avec les processus biologiques, et sont alors des outils pointus pour les étudier.

La chimie Click confère des avantages remarquables:

• Simple à réaliser – Modulaire – Modalités et échelles adaptables
• Modifications très sélectives – Opère en milieu aqueux, insensible au pH – Bioorthogonal
• Haut rendement grâce à une réaction thermodynamiquement forte – Purification facilitée
• Stéreospécifique, peut être chemo-, regio-, diastéreo- et énantio-sélectif
• Donne des conjugués physiologiquement stables
• Réponds aux principes de la chimie verte, dont solvants non toxiques, ‘atom economy’.

Cet article présente:

• • Un aperçu des principales techniques de la Chimie Click ;
  • Un éclairage sur les Alcyne /Azide CycloAdditions (AAC) innovantes:
    • nouveaux catalyseurs pour CuAAC,
    • nouveaux azides – CPAAC,
    • nouveaux Alcynes – SPAAC,
  • Autres perspectives: espaceurs clivables, supports clickables

1. Alternativement aux catalyseurs chimiques, l’induction, notamment photochimique, a ouvert d’autres champs d’applications (non abordés ici – article prochain).

Méthodes de Chimie Click pour bioconjugations

Le tableau suivant distingue plusieurs types de chimie Click utiles pour les bioconjugaisons:

Rem : Alcyne (francais) = Alkyne (anglais)
Rem: d’autres types de chimie Click ne sont pas inclus pour notre propos: autres cycloadditions de type azide-Alcyne (AAC) telle que Huisgens AAC, RuAAC, IrAAC; autres 1,3-Dipolar CycloAdditions ; autres cycloadditions de type Diels-Alder Cycloadditions et 1,3-Dipolar CycloAdditions; TAD Click (triazolinedione) et Trans-Click Reactions; Thiol-X reactions (Thiol-ene and Thiol-yne); SuFEx reactions.

La suite de l’article concerne essentiellement la chimie Click de type AAC (Azide-Alkyne Cycloadditions).

Chimie Click pour bioconjugations – insights

Introduction: reactions click standard (CuAAC)

La Chimie Click a été introduite par Sharpless en 2001 en décrivant des réactions qui avaient un haut rendement, avec un large champ d’applications, et produisaient des composés faciles à récupérer par, et de préférence sans, chromatographie. Ces cycloadditions Azide/Alcyne sont connues sous l’abréviation ‘CuAAC’ (Copper ion catalyzed AAC), mais remontent à la réaction de Michael et Huisgen (1893), et se déclinent à présent en bien d’autres réactions catalysées par divers métaux (Metal-catalyzed Azide-Alkyne Additions : MAAC).

Avec l’émergence des chimies click, des efforts importants s’appliquent aux bioconjugaisons et adressent certaines limitations. Les améliorations vinrent au niveau de nouveaux catalyseurs, puis de nouveaux dérivés d’Alcyne, puis d’azides, capables de réagir sans catalyseur, ou plus rapidement, et aussi par des fonctionnalités ajoutées au crosslinker, tel que des espaceurs clivables ou traçables.

Voir les réactifs de la chimie Click :

• Réactifs alcynes standard pour CuAAC (et CPAAC)
  liste des réticulants alcynes | biotines alcynes | agents fluorescents alcynes
  de Uptima | FluoProbes | Tous
• Réactifs azotés standard pour CuAAC (et ligature de Staudinger)
  liste de Réactifs azotés | Biotines azotées | Agents fluorescents azotés
  de Uptima | FluoProbes | Tous les azides

1.Réactions Click améliorée par des Catalyseurs et Tampons supérieurs pour CuAAC

Parce que la chimie Click standard (CuAAC) utilise une catalyse par le cuivre avec un degré d’oxydation Cu(I), qui est peu disponible de façon pratique et stable, les réactions Click ont été obtenues avec le cuivre Cu(0) oxydé en Cu(I) par des sels d’ammonium ou de chlorhydrate de triethylamine. Mais il devint plus pratique de générer le Cu(I) à partir de sels stable de Cu(II), par des réducteurs tels quel cuivre métallique Cu(0) et plus populairement avec l’acide Ascorbique. Des additifs supérieurs furent ensuite proposés pour améliorer les réactions click, notamment des agents chélatants triazole tels que les TBTA, BTTAA. Plus récemment le réactif THPTA fournit les avantages du BTTAA, plus la solubilité dans l’eau, ce qui simplifie les protocoles de conjugaison en permettant de réaliser la réaction click entièrement dans l’eau. Une enzyme DNA a aussi été proposée pour réduire le besoin de catalyseur Cu⁺ au niveau sub-micromolair.

Reactifs Uptima annexes de la chimie Click :

• Cu²⁺/TBTA complex #FY2780; Ready-to-use catalyzer for CuAAC.
• THPTA #APIFZA ; Tris((1-Hydroxy-Propyl-1H-1,2,3-Triazol-4-yl)Methyl)Amine; CAS: 760952-88-3 ; MW: 434.50.
  BTTAA #APIFU2 ; Tris(3-hydroxypropyltriazolylmethyl)amine; CAS: 1334179-85-9 ; MW: 430.52.
• Copper(II)-Sulphate (CuSO₄), #1H3691; CAS: 7758-98-7; MW: 159.6.
• Sodium Ascorbate (Na-Ascorbate), #APIG40 ; CAS: 134-03-2; MW: 198.1.

TBTA	THBTA	BTTAA

Alternativement aux catalyseurs chimiques, l’induction, notamment photochimique, a ouvert d’autres champs d’applications (non abordés ici – article prochain).

2. Réaction Click améliorée par des Azides avancés : CPAAC

De nouveaux Azides ont été proposés pour éviter l’emploi d’ions Cu(I)(II), qui sont délétères dans diverse applications biologiques (toxicité), mais aussi pour accélérer les réactions CuAAC:

Picolyl-Azides : les picolyl-azides présentent une capacité chélatante qui augmente l’efficacité du Cu+ au site de la réaction Click. La présence de cuivre reste requise, mais à de moindres concentrations, et la cinétique de réaction click CuAAC reste améliorée par l’ajout d’un chélatant (e.g. THPTA).	Schéma 3 : mécanisme de réaction du picolylAzide avec un Alcyne (CPAAC)
AzidePlus : L’AzidePlus est la nouvelle génération d’azides fonctionnalisés pour mieux chélater le Cu+. Cette structure est à ce jour reportée produire la réaction le plus rapide, et ne requiert même plus la présence d’un additif chélatant.	Schéma 4 : mécanisme de réaction de l’AzidePlus avec un Alcyne (CPAAC)

 

La chimie Click utilisant le PicolylAzide ou l’AzidePlus est référée comme CPAAC (Chelation Promoted Azide/Alkyne Conjugation), et produit des bioconjugations plus rapides que la réaction Click standard CuAAC.

Réactifs azotés avancés pour CPAAC:

• Liste des réactifs Picolyl Azides:
FluoProbesDyes Picolyl (tous); CFdyes ; TAMRA PicolylAzide; FAM PicolylAzide; Cy3/5/5.5/7 PicolylAzide.

• Liste des réactifs AzidePlus
Liste des AFDyes AzidePlus et AFDyes PicolylAzide
(more AFDyes: functionalized by –Alkyne, –DBCO, –Tetrazine, –TCO, –NHS, –Cadaverine, –Biotin)

• Réactifs Alkyne : voir ci-dessus

3. Réaction Click avec des Alcynes améliorés – SPAAC

Une autre approche pour améliorer la réactivité des Alcynes et éviter l’utilisation de catalyseur (cuivre toxique en bioconjugaison), a été introduite par Bertozzi, avec des Alcynes ‘contraintes’.

Différents types d’Alcynes contraints ont été proposés, notamment des nonynes (BCN), et plus encore des cyclooctynes (DBCO, DIBO). Ne requérant aucun catalyseur (Cu(I)(II)cytotoxiques), ces nouvelles réactions “Copper-free” sont aussi très rapides même à température ambiante. Elles sont appelées ‘Strain-promoted Alkyne -azide cycloadditions’ (SPAAC). Les cyclooctynes sont thermostables et présentent une réactivité très spécifique cad restreinte aux azides, produisant des triazoles stables avec un rendement quasi quantitatif.

 

Réactifs SPACC :

• Réactifs DBCO
Liste des DBCO Crosslinkers | DBCO Biotins |DBCO Fluorescent agents
de Uptima |FluoProbes | All

• Réactifs BCN
Liste des Crosslinker | Biotin | Fluorophores (CF colorants),
de Uptima | Biotium |

• Réactifs Azide : voir ci-dessous

4. Chimie Click avec espaceur clivable (photo-, ou chemi-clivabilité)

Plusieurs réactifs clickables sont disponibles incluant un espaceur qui est clivable. Ils formeront des conjugués, interagiront avec des composés d’intérêt puis l’espaceur sera clivé. Un composé complexé au conjugué sera ainsi relargué de façon contrôlée, et identifiable par analyse de spectrométrie de masse, ELISA, dot blot ou Western blot. Ces réactifs Click clivables permettent aussi de récupérer efficacement le(s) composé(s) liés (pull-down assays).

Réactifs clickables et photo-clivables: PC

Le bras espaceur comporte un groupe PhotoClivable (PC) qui peut être efficacement rompu par exposition aux UV: typiquement >90% est clivé en 5-25 minutes avec une lampe UV-proche, à faible intensité (ex : lampe 365 nm à 1-5 mW/cm²) et peu onéreuse.

Les PC DBCO : DBCO- PC-Biotin #AXBKW1, DBCO- PC-PEO₃-Biotin #XEU461 – TechSheet #DQP701
Les PC Azide : Biotin-PC-Azide #AXBKU1

Réactifs clickables et chimio-clivables: SS, Diazo, Dde

Le pont Disulfide (-S-S-) peut être clivé par réduction avec des thiols (bME, DTT, TCEP,…).

Disulfide Biotin agents (& -DBCO #DQP701, -Azide #AXBJQ, -Alkyne #BX1LR)

Le résidu Diazo peut être clivé en conditions douces avec 50 mM de sodium dithionite (Na₂S₂O₄).

Diazo Biotins(& -Alkyne #MRT891, -Azide #MRT881; -DBCO #MRT901)

Le résidu Dde peut être clivé par l’hydrazine en conditions douces (2% d’hydrazine aqueuse).

Diazo Biotins(& -Alkyne #XEU42A, -Azide #XEU421; -picolyl Azide #AXBLM1; -DBCO #XEU41)
Dde Fluorescent agents(& -TAMRA-Alkyne #BX1LY; TAMRA-Azide #BX1LZ)

5. Supports d’immobilisation clickables

L’agarose fonctionnalisée pour chimie Click est un outil pratique pour préparer des supports d’affinité à façon: tout haptène ou protéine peut être immobilisé en vue de purifications par affinité et tests de capture (pull-down assays).
La matrice est typiquement de l’agarose réticulée à 6 % sous forme de microbilles sphériques (50-150 μm). Avec un degré de substitution de 5 – 20 µmol groupes clickable/ml de résine, c’est idéal pour purifier des biomolécules, l’agarose étant biocompatible n’adsorbe pas de façon non spécifique comme la silice, le polystyrène et d’autres polymères, grâce à son hydrophilie naturelle.

Agaroses Clickables: -Azide #AXBI7;-PC-Azide #AXBKQ0; Alkyne #AXBHZ &MRV260, Dde Alkyne #AXBJK ; PC Alkyne #8K6942; DBCO #MRV270 & AXBJA; 4FB #IV2510
(chercher d’autres functionalized Agaroses).

6. Réactions Click alternatives à l’AAC

D’autres groupes que l’Azide et l’Alcyne utilisés en AAC permettent des réactions Click intéressantes afin de bio-conjuguer 2 composés actifs (ou plus !) :

• Nitrile Oxides : la cycloaddition d’un Alcyne avec un NitrileOxide est moins investiguée. Elle requiert un catalyseur Cu(I) (CuNOAC), ou l’utilisation d’un Alcyne contraint pour l’éviter. La cycloaddition d’un 1,3-nitrone sur une cyclooctyne DBCO (SPANC) produit une liaison triazole moins stable que les réactions AAC, mais reste très utile pour certaines applications de marquage quand une cinétique de réaction ultrarapide est critique. De même avec d’autres composés mésoioniques tels que les FluoroSydnones (K > 10⁴M^-1s^-1, surpassant les réactions avec des cycloAlcynes documentées dans la littérature).
• Tetrazines : une réaction Click utile est obtenue avec des Alcynes contraintes, notamment par demande inverse d’électron (IEDDA : Inverse Demand Diels-Alder Addition). Des groupes remarquables incluent la MethyTetrazine, PCC, …
• Phosphines : une réaction Click utile est obtenue avec des Azides (Staudinger ligation).
• Hydrazines : une réaction Click utile est obtenue entre hydrazines aromatiques et aldéhydes aromatiques (Hydrazone Chemistry).
• Oximes & Aldéhydes/Kétones : bien que non complètement abiotioque, ce type de réaction est intéressant pour des applications spécifiques (marquage/études de métabolites intracellulaires, de la biosynthèse de glycanes), mais aussi car les aldéhydes peuvent être introduits dans les protéines et d’autres biomolécules par différentes méthodes.

Ces sujets seront l’objet de prochains articles.